Przełomowe badanie nad terapią łączoną w leczeniu ADHD i depresji

Czy znamy prawdziwe oblicze MDD?

Zaburzenie depresyjne (MDD) jest najczęstszym zaburzeniem psychiatrycznym stanowiącym istotny problem zdrowia publicznego ze względu na znaczący wpływ na niepełnosprawność i ryzyko samobójstwa. Globalnie wskaźnik rozpowszechnienia wynosi od 8 do 12%, a każdego roku około 8 milionów osób popełnia samobójstwo z powodu tego poważnego zaburzenia. Zgodnie z DSM-5, epizod depresyjny charakteryzuje się utrzymującym się przez co najmniej 2 tygodnie obniżeniem nastroju, utratą motywacji i nasilonym lękiem, z towarzyszącymi objawami takimi jak zmęczenie, zaburzenia snu, zmiany aktywności psychomotorycznej czy myśli samobójcze.

Patofizjologia MDD jest złożona i obejmuje wiele układów neurotransmisyjnych, neuroplastyczność oraz procesy neurozapalne. Większość zatwierdzonych leków przeciwdepresyjnych działa poprzez transportery wychwytu zwrotnego monoamin, ich metabolizm lub przekaźnictwo. Leki pierwszej generacji zwiększają poziom monoamin poprzez hamowanie aktywności enzymów monoaminooksydazy (MAO), podczas gdy leki drugiej generacji celują w transportery wychwytu zwrotnego monoamin. Trzecia generacja to antagoniści serotoniny i inhibitory wychwytu zwrotnego. Zaburzenia funkcji poznawczych, w tym problemy z uwagą, trudności w koncentracji i zaburzenia uczenia się, stanowią istotne współwystępujące objawy MDD.

Jakie mechanizmy kryją nowe terapie?

Najnowszym lekiem przeciwdepresyjnym zatwierdzonym przez FDA jest ketamina. Jest to powszechnie stosowany środek anestetyczny, którego działanie polega na hamowaniu receptora N-metylo-D-asparaginowego (NMDR) oraz oddziaływaniu na receptory GABA, cholinergiczne i monoaminowe. Hamowanie NMDR powoduje aktywację receptora AMPA (kwas α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowy), co stymuluje szlak sygnałowy kompleksu mTORC1. Ketamina wykazuje szybkie i długotrwałe działanie przeciwdepresyjne, łagodząc objawy lęku i depresji.

Metylofenidat, pochodna amfetaminy, jest lekiem psychostymulującym pierwszego rzutu w ADHD, sprzedawanym pod nazwami handlowymi Ritalin i Concerta. Zwiększa on poziom dopaminy i norepinefryny poprzez hamowanie ich wychwytu zwrotnego i blokowanie transporterów dopaminy i noradrenaliny. Jednak długotrwałe stosowanie metylofenidatu budzi obawy dotyczące potencjalnych działań niepożądanych, w tym tików, psychozy i depresji. Europejska Agencja Leków zgłosiła nasilenie depresji i prób samobójczych po stosowaniu metylofenidatu, co podkreśla potrzebę bezpieczniejszych strategii terapeutycznych.

Hydroksylaza tryptofanowa 2 (TPH2), enzym ograniczający szybkość syntezy serotoniny w mózgu, odgrywa znaczącą rolę w stresie i depresji, co czyni go potencjalnym celem terapeutycznym. Zaburzenia syntezy serotoniny spowodowane czynnikami genetycznymi lub środowiskowymi są powiązane ze zwiększoną podatnością na stres i depresję w MDD. Ponadto impulsywność i deficyt uwagi – główne cechy ADHD – są związane ze zmienionymi poziomami serotoniny, co podkreśla znaczenie TPH2 w tych schorzeniach. Poprzez ukierunkowanie na TPH2, niniejsze badanie ma na celu zbadanie potencjału terapeutycznego farmakologicznego połączenia o podwójnym działaniu, zaprojektowanego w celu stabilizacji aktywności TPH2, modyfikacji szlaków serotoninowych i zmniejszenia objawów zarówno MDD, jak i ADHD.

Czy komputery mogą przewidzieć skuteczność leczenia?

Biorąc pod uwagę mechanizmy działania ketaminy i metylofenidatu, celem niniejszego badania było zidentyfikowanie wspólnych celów i szlaków zaangażowanych w MDD i ADHD za pomocą obliczeniowych narzędzi odkrywania leków. W niniejszym badaniu zaprojektowano koniugat leków in-silico i przetestowano go pod kątem toksyczności i właściwości lekopodobnych. Przeprowadzono analizy interakcji białkowych, dokowanie molekularne, symulacje dynamiki molekularnej oraz MMGBSA w celu oceny powinowactwa i stabilności koniugatu w systemie, dostarczając wglądu w potencjalne rozwiązania terapeutyczne dla współwystępujących zaburzeń neuropsychiatrycznych.

W celu przygotowania koniugatu ketaminy i metylofenidatu wykorzystano oprogramowanie ChemDraw. Zaprojektowano trzy koniugaty i wybrano najbardziej korzystny na podstawie właściwości chemicznych i składu. Do utworzenia wiązania między tymi związkami wykorzystano grupę NH₂ ketaminy i grupę OH metylofenidatu. Po narysowaniu koniugatu, jego strukturę 3D zaprojektowano przy użyciu narzędzia Chem3D w formacie PDB.

Struktury 3D ketaminy i metylofenidatu uzyskano z bazy danych PubChem i zidentyfikowano za pomocą ich identyfikatorów związków (CID) 3821 i 4158. Baza danych PubChem dostarcza struktury 3D ligandów uzyskane za pomocą technologii NMR. Struktury ligandów pobrano w formacie SDF, a następnie przekonwertowano na format PDB za pomocą Open Babel.

Właściwości ADME koniugatu analizowano za pomocą SwissADME. Oceniono lipofilność, rozpuszczalność, absorpcję i podobieństwo do leków zaprojektowanego koniugatu. Biorąc pod uwagę zamierzone podanie doustne koniugatu jako leku, kluczowe było ocenienie jego toksyczności. Toksyczność doustną koniugatu oceniono za pomocą serwera toxCSM, który przewiduje kluczowe parametry toksyczności, w tym odpowiedzi jądrowe, odpowiedzi na stres, odpowiedzi genomowe, środowiskowe, dawka-odpowiedź i odpowiedzi organiczne.

Jak zmapować ścieżki molekularne?

Właściwości farmakoforowe liganda, w tym jego zdolność do tworzenia wiązań z resztami białkowymi, są kluczowymi czynnikami determinującymi jego interakcję z celami biologicznymi. Charakterystykę farmakoforową koniugatu analizowano za pomocą serwera Pharmit i pakietu LigandScout. Analizy te oceniały potencjał koniugatu do tworzenia różnych typów wiązań, w tym donora wodoru, akceptora wodoru, interakcji hydrofobowych i aromatycznych, z białkiem receptorowym.

Baza danych szlaków KEGG jest szeroko uznawana za kompleksową analizę szlaków związanych z chorobami, genami i metabolizmem. Baza ta zawiera obszerne informacje o chorobach i związanych z nimi genach. W niniejszym badaniu głównym celem było ukierunkowanie na geny zaangażowane zarówno w ADHD, jak i depresję. Przeprowadzono dokładne badanie genów związanych z tymi schorzeniami i wybrano te, które są specyficznie zaangażowane w ADHD i depresję.

Zrozumienie interakcji białko-białko jest niezbędne do zrozumienia funkcji białek i ich zaangażowania w szlaki. Mapę sieci białkowej uzyskano z String v12.0, powszechnie wykorzystywanego serwera do pobierania map sieci białkowych. Po pobraniu mapy przeanalizowano interakcje białko-białko hydroksylazy tryptofanowej 2. Analiza ta miała na celu wyjaśnienie, w jaki sposób to białko wchodzi w interakcje z innymi i jaką rolę odgrywa w patofizjologii ADHD i depresji. Interakcje białko-białko odgrywają kluczową rolę w procesach komórkowych, pośrednicząc w szlakach sygnałowych, regulując ekspresję genów i modulując funkcje białek. Interakcje te mogą dostarczyć wglądu w molekularne mechanizmy leżące u podstaw różnych procesów fizjologicznych i patologicznych.

Strukturę 3D hydroksylazy tryptofanowej 2 uzyskano z Protein Data Bank (PDB) pod identyfikatorem PDB: 7WIY. Tę konkretną strukturę wybrano ze względu na uwzględnienie wszystkich łańcuchów (A/B/C/D) i wysoką rozdzielczość. Po pobraniu struktury 3D białka, oczyszczanie przeprowadzono za pomocą oprogramowania PyMOL. Obejmowało to usunięcie cząsteczek wody i jonów metali w celu zapewnienia integralności struktury białka do dalszych analiz.

Walidację struktury 3D hydroksylazy tryptofanowej 2 przeprowadzono za pomocą wykresu Ramachandrana. W tym celu wykorzystano bazę danych PDBsum i dokładnie przeanalizowano wykres Ramachandrana. Wykres Ramachandrana jest kluczowym narzędziem do oceny jakości i wiarygodności struktur białkowych. Dostarcza on informacji o jakości stereochemicznej białka poprzez wykreślenie dwukątów szkieletowych φ i ψ reszt aminokwasowych. Regiony w obrębie wykresu reprezentują dozwolone i niedozwolone konformacje na podstawie zawady sterycznej i ograniczeń wiązania wodorowego. Analizując wykres Ramachandrana, można zidentyfikować potencjalne błędy lub nieprawidłowości w strukturze białka, takie jak zniekształcone kąty wiązań lub niewłaściwe konformacje szkieletu. Zapewnienie, że struktura białka jest zgodna z oczekiwanymi rozkładami na wykresie Ramachandrana, zwiększa pewność co do jej dokładności i pomaga w interpretacji implikacji funkcjonalnych.

Miejsce aktywne hydroksylazy tryptofanowej 2 przewidziano za pomocą serwera CastP, szeroko uznawanego i często cytowanego narzędzia do takich przewidywań. Serwer ten identyfikuje kieszenie w strukturze białka, wraz z odpowiednimi resztami aminokwasowymi, i dostarcza pomiary obszaru pokrycia w angstremach kwadratowych (A²). Dokładna identyfikacja miejsca aktywnego jest kluczowa dla zrozumienia funkcji białka i potencjalnych interakcji z ligandami lub substratami.

Czy symulacje odzwierciedlają rzeczywistość?

Dokowanie dynamiki molekularnej zastosowano do dokowania koniugatu z hydroksylazą tryptofanowej 2 w celu analizy powinowactwa wiążącego i interakcji molekularnych. Do tego celu wykorzystano Autodock Vina, powszechnie stosowane narzędzie do dokowania molekularnego. Początkowo do receptora dodano polarne wiązania wodorowe, a strukturę białka zapisano w formacie PDBQT. Następnie nad miejscem aktywnym umieszczono siatkę, z wymiarami ustawionymi na x: 107,763, y: 107,762, z: 107,777 i rozmiar x: 40, y: 74, z: 40. Następnie przygotowano ligand, z kątem torsyjnym ustawionym na 6, i zapisano jako plik PDBQT. Autodock Vina przeprowadził proces dokowania, dając wartości powinowactwa wiążącego i plik out.PDBQT zawierający wyniki. Plik PDBQT białka i pliki out.PDBQT wizualizowano w PyMol, a kompleks dokowania zapisano w formacie PDB do dalszej analizy interakcji molekularnych. Interakcje molekularne kompleksu dokowania badano dalej za pomocą Ligplot+, Schrodinger Suite i PyMol.

Przeprowadzono symulację dynamiki molekularnej (MD) i MMGBSA (Molecular Mechanics Generalized Born Surface Area) przy użyciu oprogramowania Desmond firmy Schrödinger LLC. Początkowo przeprowadzono dokowanie hydroksylazy tryptofanowej 2 i koniugatu ketamina-metylofenidat w celu przewidzenia statycznego położenia cząsteczki w miejscu aktywnym białka. Następnie przeprowadzono symulacje MD, z uwzględnieniem klasycznego równania ruchu Newtona, przez 100 nanosekund, aby przewidzieć status wiązania ligandu w środowisku fizjologicznym.

Kompleks ligand-receptor poddano wstępnemu przetworzeniu za pomocą Protein Preparation Wizard w Maestro, obejmującemu optymalizację, minimalizację i adresowanie brakujących reszt, jeśli było to wymagane. Następnie system skonstruowano za pomocą narzędzia System Builder, stosując model rozpuszczalnika TIP3P (Transferable Intermolecular Potential with 3 Points) w pudełku ortorombowym w temperaturze 300 K i ciśnieniu 1 atm, wykorzystując pole siłowe OPLS_2005. Przeciwjony i chlorek sodu o stężeniu 0,15 M wprowadzono w celu neutralizacji modeli, naśladując warunki fizjologiczne. Przeprowadzono równoważenie przed symulacją, a migawki trajektorii zapisywano co 100 pikosekund do późniejszej inspekcji.

Metodologię MMGBSA, również wykonaną za pomocą Desmond, obejmowała obliczenie energii swobodnej wiązania między hydroksylazą tryptofanowej 2 a koniugatem za pomocą podejścia MMGBSA. Metoda ta łączy mechanikę molekularną z uogólnionym modelem rozpuszczalnika Born i solwatacją ciągłą powierzchni w celu oszacowania energii swobodnej wiązania kompleksu ligand-receptor.

Czy koniugat to przełom w terapii ADHD i MDD?

Koniugat ketamina-metylofenidat zaprojektowano obliczeniowo, aby pomóc w tworzeniu stabilnego wiązania między dwoma związkami. To podejście in silico pozwala na precyzyjne dopasowanie molekularne i tworzenie wiązań, zapewniając zrozumienie potencjalnej stabilności i właściwości interakcji koniugatu przed walidacją eksperymentalną.

Właściwości ADME zaprojektowanego koniugatu wykazały obiecujące wyniki, ponieważ z powodzeniem przenikał przez barierę krew-mózg (BBB) i przechodził przez przewód pokarmowy (GI), jak przedstawiono na diagramie Boiled Egg. Ponadto lekopodobność związku była doskonała, charakteryzowała się korzystnymi wartościami lipofilności i rozpuszczalności. Dodatkowo ocena toksyczności zaprojektowanego koniugatu była zadowalająca. Zaprojektowany koniugat wykazuje toksyczność w 7 parametrach: Fathead Minnow, T. Pyriformis, Crustacean, Honey Bee, Micronucleus, Respiratory Disease i hERG II Inhibitor.

Właściwości farmakoforowe koniugatu ketamina-metylofenidat analizowano w celu oceny jego potencjału do tworzenia wiązań i interakcji z białkiem receptorowym. Koniugat wykazał pięć miejsc donorowych wodoru, umożliwiających donację atomów wodoru. Dodatkowo posiadał dwa miejsca akceptorowe wodoru zdolne do akceptowania wodoru z aminokwasów w receptorze. Ponadto koniugat wykazał pięć miejsc hydrofobowych i dwa regiony aromatyczne, jeden z ketaminy i jeden z metylofenidatu.

W celu identyfikacji receptora związanego z ADHD, baza danych KEGG Disease okazała się instrumentalna. Poprzez dokładną analizę, zbadano łącznie cztery geny zaangażowane w ADHD. Wśród nich hydroksylaza tryptofanowa 2 okazała się szczególnie godna uwagi, ponieważ jest zaangażowana nie tylko w ADHD, ale także w depresję.

Jak precyzyjnie dopasować molekuły?

Interakcje białko-białko hydroksylazy tryptofanowej 2 badano za pomocą String. Poprzez tę analizę zidentyfikowano pięć białek bezpośrednio związanych z hydroksylazą tryptofanowej 2, tworząc sieć składającą się z sześciu węzłów i jedenastu krawędzi. Średni stopień węzła obliczono na 3,67, ze średnim lokalnym współczynnikiem klastrowania wynoszącym 0,867. Białka te nie tylko wchodzą w interakcje z hydroksylazą tryptofanowej 2, ale także uczestniczą w związanym z nią szlaku. Ich zaangażowanie podkreśla ich znaczenie w patofizjologii ADHD i depresji.

Struktura 3D pobrana z Protein Data Bank pod identyfikatorem: 7WIY służyła jako białko receptorowe. Struktura ta obejmuje wszystkie cztery łańcuchy (A/B/C/D) i została eksperymentalnie zweryfikowana za pomocą mikroskopii elektronowej, osiągając rozdzielczość 3,09 Å. Co ważne, nie wykryto żadnych mutacji w tej strukturze, potwierdzając jej wierność dla dalszych analiz.

Wygenerowano wykres Ramachandrana w celu walidacji struktury 3D. Ogólny wynik Ramachandrana uznano za doskonały, z 83,1% reszt znajdujących się w najbardziej korzystnym regionie i 16,8% w korzystnym regionie. Wykres ten dostarcza cennych informacji na temat jakości stereochemicznej struktury białka, potwierdzając jej wiarygodność dla dalszych analiz.

Miejsce aktywne białka przewidziano, aby ułatwić dokowanie koniugatu, dążąc do maksymalizacji powinowactwa i interakcji molekularnych. Ustalono, że to miejsce aktywne znajduje się centralnie w strukturze białka. Dodatkowo wymiary kieszeni, wraz z jej powierzchnią i objętością, wynosiły odpowiednio 8727,225 Ų i 9750,238 ų. Parametry te dostarczają kluczowych informacji na temat cech strukturalnych miejsca aktywnego białka, pomagając w optymalizacji procedur dokowania.

Procedura dokowania obejmowała ketaminę, metylofenidat i zaprojektowany koniugat na miejscu aktywnym, z ich odpowiednimi powinowactwami wiążącymi zarejestrowanymi w następujący sposób: ketamina: -6,7 kcal/mol, metylofenidat: -6,9 kcal/mol i zaprojektowany koniugat: -8,5 kcal/mol. Co godne uwagi, zaprojektowany koniugat wykazał najwyższe powinowactwo wiążące wśród tych związków, wskazując na jego potencjał jako najlepszego związku wiodącego. Po analizie interakcji molekularnych stwierdzono, że zaprojektowany koniugat tworzy wiązania wodorowe z Asp73 i wiązania hydrofobowe z Tyr446, Tyr450 i Pro449.

Czy dynamika molekularna ujawnia nowe horyzonty?

Wyniki symulacji MD ujawniają ewolucję RMSD białka “hydroksylaza tryptofanowa 2” i jego ligandów ketaminy i metylofenidatu. Lewa oś Y wykresu ilustruje RMSD białka, wskazując na odchylenie struktury białka od referencyjnego szkieletu ramki przez całą symulację. Fluktuacje w RMSD oznaczają konformację strukturalną białka w czasie, ze zmianami typowo wahającymi się między 1 a 3 Å dla małych, globularnych białek. Większe zmiany sugerują znaczące zmiany konformacyjne podczas symulacji, podczas gdy stabilizacja wokół ustalonej wartości wskazuje na konwergencję i równowagę. Prawa oś Y reprezentuje RMSD liganda, ujawniając stabilność ligandów w kieszeni wiążącej białka. Linia “Lig fit Prot” przedstawia RMSD ligandów dopasowanych do szkieletu białka, wskazując na ich stabilność względem białka. Znaczące odchylenia od RMSD białka mogą sugerować dyfuzję liganda z miejsca wiązania. Wykres ilustruje, że zarówno RMSD białka, jak i liganda stabilizują się po 20ns, wskazując na stabilną interakcję białko-ligand. Ta stabilizacja sugeruje równowagę systemu i pozwala na rygorystyczną analizę symulacji.

Wyniki symulacji MD pokazują analizę Root Mean Square Fluctuation (RMSF) dla białka “hydroksylaza tryptofanowa 2”. RMSF jest cenną metryką do zrozumienia lokalnych zmian wzdłuż łańcucha białkowego. Oblicza ona fluktuację każdej reszty względem struktury referencyjnej w czasie trajektorii symulacji. Szczyty na wykresie RMSF wskazują regiony białka doświadczające najwyższych fluktuacji podczas symulacji. Typowo, ogony N- i C-końcowe wykazują większą fluktuację w porównaniu do innych części białka. Dodatkowo, elementy struktury drugorzędowej, takie jak helisy alfa i wstęgi beta, mają tendencję do bycia bardziej sztywnymi i wykazują mniejszą fluktuację niż regiony pętli. Na tym wykresie maksymalna fluktuacja jest obserwowana przy reszcie 100, o wielkości 5,2 Å, a następnie przy reszcie 400 z fluktuacją 3,8 Å. Analiza ta dostarcza informacji o dynamicznym zachowaniu struktury białka podczas symulacji.

Ligand, “koniugat ketaminy i metylofenidatu”, wykazał wyraźne wzorce w swoich właściwościach w całej analizie symulacji MD. RMSD liganda, wskazujący na jego odchylenie od konformacji referencyjnej (zazwyczaj pierwszej ramki), wykazał początkową fluktuację, aż do stabilizacji na poziomie 1-3 Å do 5ns, utrzymując tę stabilność przez cały czas trwania 100ns. Promień żyracji (rGyr), który mierzy “rozciągłość” liganda i jest analogiczny do jego głównego momentu bezwładności, pozostał spójny w zakresie 4 Å przez całą symulację, wskazując na stabilną konformację. Wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe (intraHB) w cząsteczce liganda obserwowano sporadycznie między 20ns, 27ns, 30ns, 38ns, 58ns, 60ns, 62ns, 80ns, 84ns i 98ns. Powierzchnia molekularna (MolSA), obliczona z promieniem sondy 1,4Å i równoważna powierzchni van der Waalsa, pozostała stabilna na poziomie 90 Ų przez cały czas trwania symulacji. Dostępna dla rozpuszczalnika powierzchnia (SASA) liganda pozostała praktycznie stała na poziomie 50 Ų po początkowych 20ns, wskazując na minimalną interakcję z otaczającymi cząsteczkami rozpuszczalnika. Polarna powierzchnia (PSA), do której przyczyniają się wyłącznie atomy tlenu i azotu, wykazała niewielki spadek z 90 Ų do 80 Ų, stabilizując się na tej wartości przez pozostałą część 100ns symulacji. Ta kompleksowa analiza dostarcza informacji o dynamicznym zachowaniu i stabilności liganda “koniugat ketaminy i metylofenidatu” podczas symulacji MD.

Analiza MMGBSA po 100 nanosekundach symulacji dla interakcji hydroksylaza tryptofanowa 2-koniugat wskazuje na znaczącą zmianę w energii swobodnej wiązania. Początkowo, przy 0 ns, energia swobodna wiązania jest obliczona na -89,98 kcal/mol, podczas gdy na końcu symulacji (100 ns) znacznie się zmniejsza do -32,08 kcal/mol. Wyniki te sugerują istotną zmianę w stabilności kompleksu hydroksylaza tryptofanowa 2-koniugat w trakcie symulacji. Duży spadek energii swobodnej wiązania sugeruje osłabienie interakcji białko-ligand lub potencjalną zmianę konformacyjną w kompleksie. Tak dramatyczna zmiana w energii wiązania może wskazywać na dynamiczne przegrupowania w kieszeni wiążącej lub zmiany w orientacji liganda w miejscu aktywnym hydroksylazy tryptofanowa 2. Ogólnie rzecz biorąc, ta analiza MMGBSA podkreśla dynamiczny charakter interakcji białko-ligand i podkreśla znaczenie uwzględniania zmian czasowych w symulacjach molekularnych dla dokładnej charakterystyki wiązania liganda.

Jak serotonina steruje emocjami i funkcjami poznawczymi?

Według naszych wyników farmakologii sieciowej, TPH może odgrywać kluczową rolę w leczeniu MDD i ADHD za pomocą koniugatu ketamina-metylofenidat. Hydroksylaza tryptofanowa (TPH) jest enzymem ograniczającym szybkość z rodziny hydroksylaz aminokwasów aromatycznych zależnych od żelaza i tetrahydrobiopteryny. Katalizuje ona początkową reakcję w syntezie serotoniny. U ludzi ekspresji ulegają dwie izoformy TPH, TPH1 i TPH2. TPH1 znajduje się w jelicie, podczas gdy TPH2 znajduje się w mózgu. TPH2 odgrywa kluczową rolę w zaburzeniach nastroju i psychologicznych.

Strukturalnie TPH2 składa się z trzech głównych i funkcjonalnych domen: domeny regulacyjnej NH2-końcowej, domeny oligomeryzacji COOH-końcowej i centralnej bruzdy katalitycznej. Obecność TPH2 jest specyficzna dla neuronów, głównie ekspresja zachodzi w neuronach serotoninergicznych jąder szwu. Mutacje i polimorfizm w genie TPH2 pośrednio wpływają na funkcjonalność i wydajność enzymu TPH2 poprzez wprowadzanie zmian strukturalnych w genach. Zmiany te zmieniają normalną syntezę serotoniny. Badania udowodniły również związek zmian strukturalnych w TPH2 z zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi, dużą depresją i zaburzeniem afektywnym dwubiegunowym.

W niedawnym badaniu klinicznym Zill i wsp. ujawnili, że 2 mutacje w allelach TPH2 rozwinęły MDD i inne zaburzenia psychiatryczne. Na przykład Kim i wsp. donoszą, że specyficzny polimorfizm rs4570625 w genie TPH2 znacząco przyczynia się do rozwoju zaburzenia panicznego, podczas gdy Zhang i wsp. powiązali ten polimorfizm z rozwojem objawów pozytywnych u chińskich schizofreników Han.

Serotonina jest neuroprzekaźnikiem wytwarzanym z aminokwasu tryptofanu poprzez hydroksylację L-tryptofanu do 5-hydroksytryptofanu (5-HTP), dlatego serotonina jest również nazywana 5-hydroksytryptofanem. Odgrywa ona główną rolę w regulacji wielu funkcji, w tym poznania, stresu, apetytu, nastroju, snu, lęku, depresji i uzależnienia. Jądra szwu, skupisko neuronów serotoninergicznych w pniu mózgu, odpowiadają za syntezę i uwalnianie projekcji serotoninowych do różnych regionów mózgu, takich jak kora mózgowa, układ limbiczny i obwodowy układ nerwowy. PFC, hipokamp i ciało migdałowate otrzymują projekcje serotoninergiczne, regiony te są krytyczne dla złożonych zachowań, takich jak uwaga, poznanie, motywacja, nastrój, emocje, strach i lęk.

Zmiany w regulacji układu serotoninergicznego są znane z powodowania zmian behawioralnych i dysfunkcji mózgu. Wyższe stężenie serotoniny poprawia funkcje poznawcze i nastrój, podczas gdy niższe poziomy serotoniny i tryptofanu są związane z upośledzeniem funkcji poznawczych i depresją. Dlatego nawet niewielkie mutacje i zmiany w TPH2 są związane z zaburzeniami nastroju, depresją, zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi i zaburzeniem dwubiegunowym.

Pięć dekad temu, kiedy odkryto, że serotonina odgrywa rolę w etiologii zaburzeń nastroju, szczególnie depresji, pojawiły się leki przeciwdepresyjne, aby zwiększyć aktywność i poziomy monoaminergiczne. Osoby z depresją, agresją i impulsywnością posiadają zmniejszoną serotoninę lub metabolit kwas 5-hydroksyindolooctowy (5HIAA) w mózgu, więc jedną z możliwości zmniejszenia objawów i depresji jest egzogenne dostarczanie tryptofanu lub serotoniny z lub bez leków przeciwdepresyjnych.

Regulacja produkcji serotoniny i projekcji do niektórych regionów mózgu, takich jak kora przedczołowa (PFC), hipokamp i ciało migdałowate, obejmuje złożone mechanizmy, które obejmują szlak sygnałowy cAMP/PKA, ale nie jest wyłącznie zależna od tego szlaku. Kilka czynników reguluje serotoninę, takich jak zmiany strukturalne, procesy molekularne i sieci oddziałujących komórek. Również aktywność TPH jest modulowana przez sygnalizację cAMP/PKA.

Stosowanie selektywnych inhibitorów enzymatycznych okazało się skuteczną opcją leczenia. Na przykład, w chorobach związanych z serotoniną, p-chlorofenyloalanina wiąże się z TPH i reguluje stężenia serotoniny. Alternatywne opcje to stymulacja syntezy TPH, stabilizacja interakcji molekularnej białko-białko lub stosowanie chaperonów farmakologicznych. Aby odkryć skuteczny chaperon farmakologiczny (PC), identyfikacja i badanie przesiewowe są kluczowe, aby ujawnić właściwości strukturalne, biologiczne i farmakologiczne PC. PC koryguje i stabilizuje strukturę białka oraz reguluje interakcję białko-białko.

Jakie perspektywy otwierają nowe badania?

Głęboka analiza obecnych danych ujawniła, że koniugat ketamina-metylofenidat ma potencjał, aby działać jak PC. W przeciwieństwie do niektórych leków opartych na enzymach, koniugat jest związkiem wiodącym, który może przekraczać przewód pokarmowy i barierę krew-mózg z naruszeniem reguły Lipkina i minimalną toksycznością. Mapowanie sieci białkowej ujawniło, że zidentyfikowano pięć białek bezpośrednio związanych z TPH2: TPH1, PCBD1, PCBD2, DDC i IDO1. Wszystkie są ważne dla syntezy serotoniny; dostępności i enzymu wymaganego dla serotoniny. Białka te nie tylko wchodzą w interakcje z hydroksylazą tryptofanowej 2, ale także uczestniczą w związanym z nią szlaku. Ich zaangażowanie podkreśla ich znaczenie w patofizjologii ADHD i depresji. Wykres Ramachandrana dostarcza cennych informacji na temat jakości stereochemicznej struktury białka, potwierdzając jej wiarygodność dla dalszych analiz. Wyniki pokazały dobrze złożoną strukturę i funkcjonalność białka. Wyniki dokowania molekularnego również faworyzowały nasz koniugat z najwyższym powinowactwem wiążącym z TPH2. Po analizie interakcji molekularnych stwierdzono, że zaprojektowany koniugat tworzy wiązania wodorowe z Asp73 i wiązania hydrofobowe z Tyr446, Tyr450 i Pro449, interakcja ta jest korzystna w utrzymaniu integralności i funkcjonalności białek, takich jak kataliza, sygnalizacja i integracja molekularna.

Wykres ilustruje wyniki symulacji MD, zarówno RMSD białka, jak i liganda stabilizują się po 20ns, wskazując na stabilną interakcję białko-ligand. Ta stabilizacja sugeruje równowagę systemu, pozwala na rygorystyczną analizę symulacji i dostarcza informacji o dynamicznym zachowaniu i stabilności liganda “koniugat ketaminy i metylofenidatu” podczas symulacji MD. Ponadto analiza MMGBSA podkreśla dynamiczny charakter interakcji białko-ligand i podkreśla znaczenie uwzględniania zmian czasowych w symulacjach molekularnych dla dokładnej charakterystyki wiązania liganda.

Koniugat ketamina-metylofenidat jest związkiem wiodącym, który wiąże się w miejscu aktywnym enzymu TPH2 z dobrym powinowactwem wiążącym, a zmiany konformacyjne związane z tym wiązaniem były stabilne i prowadziły do stabilizacji białka w symulacji MD. Warto wspomnieć, że synapsy serotoninergiczne i szlaki TPH2 są klasycznymi szlakami sygnałowymi nie tylko w ADHD, ale także w MDD, dlatego są one również uważane za aktualne gorące kierunki do badania dysregulacji neuroprzekaźników w zaburzeniach uwagi i nastroju.

W przyszłości planujemy przeprowadzenie eksperymentów in vivo, aby przetestować ten koniugat w warunkach przedklinicznych. Wkrótce zostaną przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach, aby zweryfikować nasze wyniki in silico i zbadać rolę tego koniugatu w zachowaniach związanych z ADHD i depresją u szczurów modelowych oraz mechanizmy syntezy, szlaku sygnałowego i poziomu monoamin. Eksperyment ten dostarczy nowych spostrzeżeń i podstaw do klinicznego leczenia ADHD i MDD.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na innowacyjnym podejściu do leczenia zaburzenia depresyjnego (MDD) i ADHD poprzez wykorzystanie koniugatu ketaminy i metylofenidatu. Naukowcy przeprowadzili szczegółową analizę in silico, badając interakcje tego związku z hydroksylazą tryptofanową 2 (TPH2), kluczowym enzymem w syntezie serotoniny. Zaprojektowany koniugat wykazał obiecujące właściwości, w tym zdolność do przenikania bariery krew-mózg i przewodu pokarmowego, przy minimalnej toksyczności. Symulacje molekularne potwierdziły stabilne wiązanie koniugatu z TPH2, z najwyższym powinowactwem wiążącym spośród badanych związków. Analiza dynamiki molekularnej wykazała stabilną interakcję między białkiem a ligandem po 20 nanosekundach symulacji. Badanie otwiera nowe perspektywy w leczeniu współwystępujących zaburzeń psychiatrycznych, choć wymaga dalszej weryfikacji w badaniach przedklinicznych i klinicznych.